6月5日，記者從中國科學院青島能源所獲悉，該所單細胞中心基于自主研制的RAGE(重力驅動單細胞液滴包裹拉曼分選)技術、儀器和相應試劑盒，首次實現了精確到一個細菌細胞、全基因組覆蓋度超過92%的環境菌群scRACS-Seq，為環境微生物組原位代謝功能研究提供了一個強有力的新工具。

單細胞拉曼分選耦合測序(RACS-Seq)是剖析環境菌群功能機制的重要手段，但拉曼分選后單個細菌細胞基因組的覆蓋度通常低于10%，極大限制了其應用。

土壤是地球上最重要的生態系統之一，土壤微生物組的代謝活動支撐著農業與畜牧業，也在地球元素循環、全球氣候變化中起著關鍵性作用。同時，土壤菌群也是地球上最多樣與最復雜的微生物組之一，而其中大部分微生物尚難以培養，因此，單個細胞精度的拉曼分析-分選-測序(Single-cell RACS-Seq，簡稱scRACS-Seq)策略，是剖析土壤等環境菌群之代謝機制的重要手段。然而針對環境菌群的scRACS-Seq一直以來存在兩大瓶頸，一是難以無損、快速地獲取具有特定拉曼表型的單個細胞;二是難以獲得高覆蓋度的單細胞基因組數據。這已經成為scRACS-Seq技術體系在復雜菌群中得以廣泛應用的關鍵瓶頸。

針對這一業界共性難點問題，該所單細胞中心荊曉艷、公衍海和徐騰等組成的聯合攻關小組，基于前期發明的RAGE-Seq技術(Raman-activated Gravity-driven Encapsulation and Sequencing; Xu, et al, Small, 2020)，從液相拉曼分析穩定同位素底物飼喂的土壤菌群出發，將特定拉曼表型的細菌單細胞精準分離并包裹到皮升級液滴中，進而耦合下游基因組測序。結果表明：(i)土壤菌群中細胞代謝活躍的低豐度物種(如Corynebacterium spp., Clostridium spp., Moraxella spp., Pantoea spp. 和 Pseudomonas spp.等)可經耦合重水飼喂與標記的RAGE-Seq精準地識別和分選，其單細胞基因組覆蓋率可高達近93%;(ii)同樣，基于RAGE-Seq，含類胡蘿卜素的土壤微生物細胞(如Pantoea spp., Legionella spp., Massilia spp., Pseudomonas spp., 和Pedobacter spp.等)能實現單個細胞分辨率、高基因組覆蓋度的代謝重建，從而完整、深入地挖掘其類胡蘿卜素合成途徑;(iii)這些“原位”合成類胡蘿卜素的土壤微生物細胞中，既有代謝活躍的，也相當部分是惰性的，表明基于純培養的策略勢必錯失這些代謝惰性的功能微生物，因此“原位”、單細胞精度的功能細胞識別和分離，對于全面、客觀的菌群功能剖析和資源挖掘具有重要意義。

據介紹，該工作還通過組分與狀態均精確可控的人工菌群，建立了系統且嚴格的scRACS-Seq質量評價與控制體系。基于該體系，發現該技術能將不同拉曼表型的細菌單細胞從菌群中快速、精準分離，在保證單細胞拉曼光譜質量的同時，分選準確性達100%。以來自于靶標細胞周圍水相的空液滴為陰性對照，發現靶標細胞序列中被菌群中其他細胞DNA污染的概率極低。上述工作定量證明了scRACS-Seq的靈敏度、特異性和可靠性。

作為RACS技術家族的新成員，scRACS-Seq可以在復雜菌群中以單個微生物細胞的分辨率建立新陳代謝與基因組的聯系，從而精確回答“誰在做什么，為什么”。在此基礎上，單細胞中心研制和產業化了單細胞拉曼分選-測序耦合系統(RACS-Seq儀器)，以及相應的RAGE芯片和單細胞分析試劑盒(包括環境樣品中微生物單細胞提取與制備、穩定同位素飼喂細胞、單細胞核酸裂解與擴增等環節)。該系統廣譜適用于細菌、古菌、真菌和動植物細胞，正服務于涵蓋各種復雜生態系統的研究和應用。

該工作由該所單細胞中心徐健研究員和馬波研究員主持，與中國科學院南京土壤研究所賈仲君研究員等合作完成。 (記者 王健高 通訊員 劉佳)